Ciencias ecologicas. 1983-2013: Treinta años de investigaciones chilenas

Por Vivian Montecinos y Julieta Orlando

Este libro, el primero de su tipo, proyecta el quehacer y las experiencias sobre las investigaciones ecológicas realizadas en el territorio nacional por un grupo particular y variado de científicos. No pretende detallar los principales problemas o temas de la ecología, sino que más bien está escrito en un lenguaje accesible a un público no especialista, ofreciendo la oportunidad de acercarse a la historia natural del país mediante ejemplos que tienen relación con problemáticas nacionales basados en información de excelencia avalada por las publicaciones de circulación internacional correspondientes a cada capítulo. Varios de los autores han optado por un relato muy personal que permite contribuir a la divulgación científica de las ciencias ecológicas y, por tanto, es también un libro complementario para la labor de docentes y estudiantes de la ecología. Hacer ecología es hacerse preguntas sobre la naturaleza: ¿cuál es la diversidad de microorganismos en diferentes ambientes del territorio nacional?, ¿cómo reconstruir la vegetación nativa de Chile?, ¿cómo han evolucionado los sistemas reproductivos en las plantas?, ¿qué aproximaciones sirven para estudiar la evolución entre plantas e insectos?, ¿cómo entender los procesos de especiación en insectos y reptiles?, por nombrar algunas. En las páginas de esta obra se incluyen investigaciones sobre biogeografía y biodiversidad en suelos, bosques, agroecosistemas, ríos, lagos y océanos, exponiendo tanto aspectos teóricos como investigaciones de laboratorio y terreno realizadas con diferentes niveles de análisis, desde métodos clásicos hasta herramientas moleculares, satelitales y estadísticas.

• Idioma: Español
• Editorial: Editorial Universitaria de Chile
• Fecha de lanzamiento: 22 jul 2022
• ISBN: 9789561127364

Vista previa del libro

C

APÍTULO

I

Ecología Microbiana: la importancia de aquello que no vemos

M

ARGARITA

C

ARÚ

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ERLY DE

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ULIETA

O

RLANDO

Introducción

La invitación para escribir este capítulo sobre Ecología Microbiana es una oportunidad para mostrar lo que hacemos, pero también para reflexionar y contar por qué nos interesan estos temas. Habría que comenzar diciendo que nuestro grupo de investigación no nació desde la Ecología sino desde la Microbiología, y más específicamente desde la Genética y la Biología Molecular de microorganismos. Es así como nuestra formación e investigación inicial estaban más relacionadas con interrogantes en los procesos moleculares que con preguntas en ecología. Sin embargo, en la búsqueda de nuevos modelos microbiológicos de estudio, el trabajo con bacterias filamentosas del género Frankia nos permitió descubrir que las interacciones microbianas con organismos como las plantas, daban cuenta de importantes procesos ecosistémicos, como la fijación biológica de nitrógeno. El estudio de esta asociación simbiótica nos llevó a preguntarnos sobre la diversidad de algunos microorganismos que fijan nitrógeno en asociación con plantas, como las bacterias del género Rhizobium y las cianobacterias del género Nostoc. Estos trabajos iniciales nos llevaron a estudiar los microorganismos directamente en su ambiente, utilizando herramientas moleculares adecuadas que nos permitieran su detección e identificación. Con este nuevo enfoque podríamos conocer cómo se organizan cuando se encuentran formando comunidades naturales, y cómo responden frente a perturbaciones bióticas, como la presencia de una planta, o modificaciones en factores abióticos, como la disponibilidad de agua o de nitrógeno.

Actualmente estamos interesados en nuevas interacciones microbianas, los líquenes, y el esfuerzo se ha concentrado en medir los factores ecológicos que están involucrados en el proceso de liquenización de la asociación Peltigera-Nostoc. Paralelamente, nuestros estudios de comunidades se han orientado hacia la ecología de invasiones, pero desde la perspectiva microbiana. Para ello, las comunidades fúngicas experimentales son buenos modelos de estudio que nos permiten abordar preguntas sobre los factores que favorecen el éxito de un invasor microbiano o cómo la llegada de este afecta la estructura genética y la diversidad metabólica de la comunidad residente. A lo largo de estos años estas líneas de investigación llamaron la atención tanto de estudiantes de pregrado como de posgrado, quienes se unieron a estos trabajos a través del desarrollo de sus tesis, y también nos han permitido establecer diversas colaboraciones nacionales e internacionales que han enriquecido nuestro conocimiento de los microorganismos en el ambiente.

1.1. La Ecología Microbiana, una disciplina repleta de desafíos

La Microbiología [del griego mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia)] y la Ecología [del griego oikos (hogar) y logos (ciencia)], conjuntamente abarcan el estudio de la vida microscópica, su distribución, abundancia, y las numerosas y aún desconocidas interacciones que establecen entre ellos, con el resto de la biota (animales y plantas) y con el ambiente que los rodea.

Los microorganismos son seres vivos diminutos (del orden de los micrómetros, de ahí su nombre), que individualmente son demasiado pequeños para verlos a simple vista, aunque cuando están agrupados forman colonias visibles a ojo desnudo. En este grupo se incluyen las bacterias, arqueas, hongos (levaduras y hongos filamentosos), virus, protozoos y algas microscópicas. En conjunto ellos constituyen la fracción más abundante y diversa de la biota del planeta.

Generalmente, asociamos a los microorganismos con infecciones o con el deterioro de alimentos; pero ellos son solo una minoría. En su gran mayoría los microorganismos son benéficos y contribuyen de una forma crucial en el bienestar y calidad de vida en la Tierra, ayudando a mantener el funcionamiento y sustentabilidad de los ecosistemas. Ellos son la base de la cadena alimentaria, realizan funciones claves en el ciclado de nutrientes, cumplen un papel depurativo al degradar y reducir los productos de desecho, y también son capaces de incorporar a un ambiente nutrientes esenciales para la biota. Ciertos representantes microbianos son los únicos capaces de fijar nitrógeno atmosférico, mientras que algunas bacterias y algas juegan un papel importante en la fotosíntesis, ambos procesos críticos para el mantenimiento de la vida sobre la Tierra. Además, todos los animales, incluido el hombre, dependen de los microorganismos para realizar funciones como la digestión y la síntesis de algunos nutrientes como las vitaminas. Asimismo, las plantas establecen múltiples asociaciones benéficas con bacterias y hongos, los cuales colaboran con su crecimiento.

Actualmente sabemos que los microorganismos se encuentran en todas partes, colonizando todos los ambientes, incluso los más extremos, donde cumplen las más diversas funciones. Sin embargo, conocemos solo una mínima parte de esta microbiota, por lo que el gran desafío ahora es relacionar las teorías y los conceptos ecológicos y microbiológicos clásicos, con el uso de herramientas moleculares, y así poder aplicarlos en estos seres vivos difíciles de ver, diferenciar y cuantificar en sus hábitats naturales.

1.2. ¿Cómo estudiar seres tan pequeños?

1.2.1. En búsqueda de las condiciones que permiten su cultivo

Un método fundamental para estudiar los microorganismos es cultivarlos en un medio líquido o en la superficie de un medio semisólido de agar. Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes, que en concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de algunos microorganismos. En general, están compuestos por fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo y micronutrientes. Los medios de cultivo semisólidos permiten aislar o purificar un microorganismo a partir de muestras heterogéneas, como suelo, sedimento o agua, en las cuales se encuentran muchos tipos de microorganismos. Para ello la muestra se disemina en un medio de cultivo semisólido selectivo que favorece el crecimiento de un tipo de microorganismo y se incuba a una temperatura óptima para su crecimiento; así ellos se multiplican y tras muchos ciclos reproductivos, forman colonias macroscópicas compuestas por decenas de millones de células genéticamente idénticas a la original (clones). Si esta colonia individual se traspasa a su vez a un nuevo medio, crecerá como cultivo puro de un solo tipo de microorganismo.

Muchos microorganismos son tan parecidos morfológicamente que es imposible diferenciarlos solo con el uso del microscopio; en ese caso, para identificar cada tipo, se estudian sus características metabólicas haciéndolos crecer en medios de cultivo con suplementos especiales. Sin embargo, a pesar de existir un amplio conocimiento de las características metabólicas de diversos grupos microbianos y debido a la gran diversidad de microorganismos que existe, aún se hace difícil cultivar la mayoría de ellos; de hecho, se considera actualmente que solo una pequeña fracción de los microorganismos presentes en el ambiente es cultivable (1-10%). Es por ello que hay un gran interés en buscar medios y condiciones de cultivo adecuados para aquellos microorganismos catalogados como aún no cultivables.

1.2.2. Los microcosmos, pequeños mundos

Como alternativa al estudio con microorganismos aislados, los microcosmos permiten estudiar los microorganismos en conjunto, como comunidades, sin separar a sus integrantes. Las comunidades microbianas, tanto naturales como experimentales, han representado modelos novedosos que permiten abordar distintas temáticas de la Ecología Microbiana. La principal ventaja de los microcosmos es que permiten reducir la complejidad asociada a los sistemas naturales y aportar como una nueva herramienta al conjunto de aproximaciones clásicas utilizadas en la Ecología Microbiana. Los ensayos en microcosmos permiten disponer de un sistema controlado y reproducible que intenta simular los procesos e interacciones de los componentes en una fracción del ambiente estudiado. Si bien su uso para estudiar procesos ecosistémicos es criticado por estar temporalmente limitado y no reflejar las complejas relaciones entre especies que tienen lugar en el medio natural, se puede argumentar en su favor que los microorganismos operan a escalas temporales y espaciales mucho más reducidas y por tanto esta aproximación resulta útil para responder las interrogantes planteadas.

Dos famosos microbiólogos, Sergei Winogradsky (1856-1953) y Martinus Beijerinck (1851-1931), fueron los primeros en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos que conviven en un mismo hábitat y cuyas poblaciones se mezclan. Una demostración simple de laboratorio utilizando ensayos de microcosmos, la columna de Winogradsky, ilustra cómo diferentes microorganismos interactúan entre sí de forma tal que la actividad metabólica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa (Figura 1). Estas columnas, que llevan el nombre del microbiólogo ruso que las utilizó por primera vez, son sistemas completos autorreciclables, puestos en marcha solamente por energía lumínica. Inicialmente, todos los microorganismos están presentes en muy baja proporción, pero cuando la columna se mantiene por 2 o 3 meses a temperatura ambiente con una fuente de luz, los distintos tipos de microorganismos proliferan y ocupan distintas zonas de la columna donde las condiciones ambientales favorecen sus actividades específicas.

Figura 1. Columna de Winogradsky. Seguimiento fotográfico temporal, durante 56 días de exposición solar, que muestra la evolución de tres columnas diferentes (C1, C2 y C3). En la parte inferior de la figura se muestra la vista de cada columna desde arriba.

Estudios basados en modelos microbianos experimentales han sido un gran aporte a la teoría ecológica; como por ejemplo los clásicos estudios con protozoos de Gause, que permitieron generar modelos predictivos depredador-presa; o los experimentos con diatomeas de Tilman, que permitieron generar modelos de competencia relacionados con la dinámica de los recursos de las comunidades. De este modo, los sistemas microbianos pueden ser una herramienta de gran utilidad en Ecología.

1.2.3. Aproximándonos a su diversidad a través de las moléculas

El estudio de ensambles microbianos complejos, sin aislar y purificar sus componentes, plantea el desafío de cómo identificar a las unidades que los componen. Es así que el desarrollo de diversas técnicas moleculares, basadas en el análisis de secuencias de

ADN

(ácido desoxirribonucleico) y otras macromoléculas, significó un gran avance para la Ecología Microbiana y los estudios asociados a la diversidad y la filogenia. Estos métodos están basados en el uso de marcadores moleculares, tales como genes ribosomales o genes funcionales, que permiten acceder directamente a los microorganismos sin necesidad de aislarlos y preservarlos como cultivo puro, lo que permite acceder a la fracción microbiana que no puede cultivarse en condiciones de laboratorio. Sin embargo, estas técnicas independientes del cultivo microbiano presentan sesgos inherentes a las metodologías asociadas a los métodos moleculares. La extracción de

ADN

puede ser una limitación, ya que no todos los microorganismos son igualmente sensibles a los métodos de extracción; entonces, el

ADN

obtenido puede no representar la abundancia relativa en la que se encuentran los microorganismos en la muestra. La técnica de amplificación en cadena de la polimerasa (

PCR

), en la cual se basa la mayoría de estos procedimientos experimentales, también presenta inconvenientes, como por ejemplo la especificidad de los partidores utilizados, los cuales a pesar de considerarse en muchos casos universales, no cubren toda la diversidad de microorganismos existente. A pesar de las limitaciones, el enfoque experimental con técnicas moleculares basadas en análisis de marcadores moleculares, tales como la clonación-secuenciación y técnicas de fingerprinting como el polimorfismo en la longitud de los fragmentos terminales de restricción (

TRFLP

, por sus siglas en inglés) o la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (

DGGE

, por sus siglas en inglés), han sido una alternativa para caracterizar la diversidad microbiana presente en muestras ambientales.

La aproximación clásica para determinar la composición de microorganismos presentes en una muestra ambiental, es decir, identificar los miembros de una comunidad, consiste en la construcción de genotecas mediante la amplificación de marcadores moleculares, la individualización de los productos de amplificación por clonación, y la secuenciación de los insertos para su comparación con bases de datos donde las secuencias tienen asociada una caracterización taxonómica (Figura 2). Para determinar la cobertura de la composición presente en una muestra ambiental obtenida mediante la construcción de una genoteca hay que tener presente que el número de tipos de organismos observados aumenta con el esfuerzo de muestreo hasta que todos los tipos se observan. La relación entre el número de tipos observados y el esfuerzo de muestreo proporciona información acerca de la diversidad total de la comunidad en la muestra, patrón que se puede visualizar mediante el trazado de curvas de rarefacción.

En la actualidad el desarrollo de las técnicas de secuenciación masiva (e.g. pirosecuenciación) permite abordar la composición de comunidades microbianas mediante la amplificación y secuenciación de los productos directamente, obteniéndose así miles de secuencias diferentes desde una muestra. Estos métodos permiten detectar un mayor número de representantes de la comunidad aunque la limitante actualmente se encuentra en el análisis y la interpretación de la gran cantidad de información que brindan.

Figura 2. Representación del método de clonación-secuenciación. A. Extracción del

ADN

desde los componentes microbianos de una muestra ambiental; B. Amplificación de fragmentos de

ADN

mediante

PCR

; C. Ligación de los productos de amplificación en vectores de clonación (plasmidios); D. Transformación de células hospederas; E. Selección de clones portadores de plasmidios con los fragmentos de

ADN

amplificados; F. Secuenciación de los fragmentos de

ADN

clonados y análisis bioinformático de las secuencias.

Por otro lado, para determinar la estructura de una comunidad, es decir los tipos de microorganismos o filotipos presentes (riqueza) y cuánto hay de cada uno de ellos (abundancia), se han desarrollado técnicas de fingerprinting, las cuales permiten la separación de fragmentos de

ADN

del mismo largo, pero con diferente secuencia. El método del

TRFLP

(Figura 3) se basa en la amplificación por

PCR

de un marcador molecular usando uno de los partidores marcado en su extremo 5’ con una molécula fluorescente. El producto amplificado y marcado en uno de sus extremos es posteriormente digerido con una enzima de restricción, la cual hace cortes específicos en la molécula de

ADN

. Los fragmentos terminales de restricción (

TRF

s) marcados, son separados por electroforesis capilar. Por otra parte, el método del

DGGE

(Figura 3) también se basa en la amplificación por

PCR

de un marcador molecular, usando en este caso uno de los partidores con un

GC-

clamp, los cuáles se resuelven por electroforesis en gel con un gradiente químico desnaturalizante. Cuando un fragmento de

ADN

se encuentra en las condiciones que producen su desnaturalización, la doble hélice se despliega y la migración de dichas cadenas en una electroforesis en gel se detiene o es considerablemente más lenta, por lo que la separación de los filotipos se produce de acuerdo con la composición nucleotídica de los fragmentos. Los perfiles tanto de

TRFLP

como de

DGGE

proporcionan datos cuantitativos sobre cada filotipo detectado, incluyendo tamaño en pares de bases, y fluorescencia o intensidad de banda asociadas, respectivamente. Estos métodos permiten la rápida comparación de la diversidad de secuencias de

ADN

y pueden ser utilizados para la diferenciación y comparación de las comunidades microbianas presentes en muestras ambientales.

Figura 3. Representación del método de

TRFLP

(panel izquierdo). A. Extracción del

ADN

(dobles hélices) desde los componentes microbianos de una muestra ambiental; B. Amplificación de marcadores moleculares mediante

PCR

usando partidores marcados (con fluoróforo en extremo 5’) y digestión con enzimas de restricción de los amplicones generándose fragmentos de diferente tamaño en función de la secuencia nucleotídica; C. Separación de amplicones mediante electroforesis capilar y detección de fragmentos marcados con fluorescencia (fragmentos terminales o

TRF

s). Los diferentes fragmentos (moléculas de distinto color) se digerirán según su composición nucleotídica y presentarán diferentes posiciones según su tamaño (pb: pares de bases) en los electroferogramas; mientras que la fluorescencia (UF: unidades de fluorescencia) asociada a cada fragmento es una medida de su abundancia en la muestra. Representación del método de

DGGE

(panel derecho). A. Extracción del

ADN

(dobles hélices) desde los componentes microbianos de una muestra ambiental; D. Amplificación de marcadores moleculares mediante

PCR

usando partidores especiales (con

GC-

clamp en extremo 5’); E. Separación de los amplicones mediante electroforesis en gel utilizando condiciones desnaturalizantes. Fragmentos de igual tamaño, migrarán diferencialmente según su composición nucleotídica (moléculas de distinto color).

1.2.4. Los microorganismos también trabajan

Para estudiar la diversidad metabólica de las comunidades microbianas se requiere conocer el espectro de nutrientes que ellas son capaces de metabolizar. Para ello se utilizan diversos ensayos en microplacas, los cuales se encuentran diseñados para obtener un patrón de utilización de nutrientes por parte de los diferentes integrantes de las comunidades microbianas, como por ejemplo, bacterias Gram positivas, Gram negativas y hongos filamentosos. En todos los casos las placas contienen diferentes fuentes de carbono que al ser metabolizadas por los microorganismos generan compuestos que son detectados colorimétricamente. Las placas inoculadas se incuban en condiciones controladas de temperatura y la aparición de color se registra periódicamente con un espectrofotómetro.

Por otro lado, se pueden medir actividades enzimáticas específicas como aquellas relacionadas con el ciclo del nitrógeno. La fijación de nitrógeno, la cual consiste en la reducción del nitrógeno molecular atmosférico y su transformación a amonio, puede medirse por el ensayo de reducción de acetileno. La utilización de sustratos alternativos por la nitrogenasa ofrece la posibilidad de determinar la reducción de acetileno a etileno, el cual puede medirse fácilmente en muy bajas concentraciones por cromatografía de gases. La desnitrificación potencial (tasa de producción de óxido nitroso) se puede determinar mediante un ensayo de inhibición de la actividad enzimática por acetileno. En este ensayo el acetileno bloquea el paso de óxido nitroso a nitrógeno molecular, el cual cataliza la enzima óxido nitroso reductasa, produciéndose una acumulación de óxido nitroso. La concentración de este gas puede medirse por cromatografía y se usa como medida de la tasa de desnitrificación. Finalmente, la nitrificación neta (tasa de producción de nitrato) y la amonificación (tasa de producción de amonio) se pueden estimar mediante la pendiente de las curvas del contenido de nitrato y el contenido de amonio versus el tiempo, respectivamente. Tanto el nitrato como el amonio pueden cuantificarse mediante métodos colorimétricos o utilizando electrodos de intercambio iónico.

1.3. Aunque pequeños, son buenos socios

Una de las propiedades más interesantes que poseen los microorganismos es su gran capacidad para establecer todo tipo de interacciones con los otros componentes de la biota, sean estos otros microorganismos, animales o plantas. Entre estas interacciones, nos hemos interesado especialmente en la simbiosis actinorrícica, la simbiosis liquénica y la asociación de la microbiota rizosférica con una planta invasora. Además, otras simbiosis mutualistas que hemos estudiado son aquellas que establecen cianobacterias del género Nostoc con plantas nativas del género Gunnera (Guevara y col., 2002), la simbiosis rizobio-leguminosa (Junier y col., 2009a; 2009b; 2014), y la asociación del hongo Trichoderma harzianum con plantas (Donoso y col. 2008).

1.3.1. Plantas actinorrícicas, Frankia y el ciclo del nitrógeno

La disponibilidad de nitrógeno combinado presente en la rizosfera (zona del suelo directamente influenciada por la raíz de una planta) es un importante factor que determina la productividad y fertilidad del suelo. La distribución de los componentes nitrogenados en los ecosistemas depende de los procesos microbiológicos que regulan el ciclo biogeoquímico. Tres grupos microbianos participan en llevar a cabo las principales etapas del ciclo del nitrógeno: las bacterias fijadoras de nitrógeno, las bacterias nitrificadoras y las bacterias desnitrificadoras. Las primeras son las que transforman el nitrógeno molecular atmosférico en una forma combinada accesible para el resto de los seres vivos (Recuadro 1). Entre ellas se encuentra Frankia (Figura 4), una bacteria fijadora de nitrógeno que induce la formación de nódulos radiculares en un grupo heterogéneo de plantas denominadas actinorrícicas.

R

ECUADRO

1. L

A ENZIMA NITROGENASA Y SU PROTECCIÓN FRENTE AL OXÍGENO

.

La fijación de nitrógeno es catalizada por la enzima nitrogenasa, la cual se inactiva rápida e irreversiblemente por oxígeno. Por lo tanto, existen diversas estrategias para la protección de esta enzima: algunas bacterias se desplazan hacia zonas con bajas tensiones de oxígeno, otras lo eliminan rápidamente por respiración, en otros casos se forman complejos con una proteína, se producen capas mucosas impermeables, o se compartimentaliza la enzima en un tipo especial de célula (heterociste), entre otras estrategias. En el nódulo de los rizobios con las leguminosas, una de las más conocidas interacciones que fijan nitrógeno biológicamente, la nitrogenasa está protegida por la leghemoglobina, una proteína que une el oxígeno. En el caso del actinomicete Frankia, protege su nitrogenasa en una estructura especializada que se forma por diferenciación de sus filamentos conocida como vesícula. Las vesículas tienen paredes lipídicas multilaminares que actúan como barreras a la difusión del oxígeno y poseen una alta actividad superóxido dismutasa, la cual atrapa radicales de oxígeno altamente reactivos.

La plantas que se asocian simbióticamente con Frankia se encuentran distribuídas en 25 géneros incluidos en 8 familias: Betulaceae, Casuarinaceae, Coriariaceae, Datiscaceae, Elaeagnaceae, Myricaceae, Rhamnaceae y Rosaceae. Las plantas actinorrícicas son árboles pequeños o arbustos leñosos de poca importancia comercial que se desarrollan en diversos hábitats desde las tundras árticas a las regiones templadas y tropicales. Frecuentemente se establecen como vegetación pionera en suelos marginales, siendo de gran utilidad en la reforestación; sin embargo, muchas tienen la capacidad de persistir como especies dominantes o componentes más estables en las comunidades. En Chile se encuentran varias especies nativas de la familia Rhamnaceae, las cuales establecen simbiosis con Frankia. A partir de estas plantas aislamos y caracterizamos fenotípica y genéticamente, cepas de Frankia asociadas a plantas de Colletia hystrix, Retanilla ephedra, Talguenea quinquenervis, Trevoa trinervis y Discaria serratifolia (Carú y col., 1990; Carrasco y col., 1992; Carú, 1993). Cuando comenzamos nuestros estudios no había cepas aisladas desde esta familia de plantas, y por lo tanto eran consideradas como cepas recalcitrantes al cultivo. Estas cepas nativas se caracterizan por su naturaleza filamentosa, por su habilidad para fijar nitrógeno en vida libre y en simbiosis, y por su capacidad de re-infectar el sistema radicular de hospederos de la misma especie y de otros géneros de plantas de las familias Rhamnaceae y Elaeagnaceae (Carú y Cabello, 1999; Clawson y col., 1998; Carú y col., 2003).

Figura 4. Frankia, una actinobacteria. A. Colletia hystrix, una planta actinorrícica nativa del matorral de Chile Central que se asocia con Frankia; B. Nódulos radiculares de Colletia hystrix; C. Microfotografía electrónica de barrido del micelio producido por Frankia exhibiendo vesículas (V) que protegen a la nitrogenasa del oxígeno (la barra representa 3 µm); D. Acercamiento a una vesícula de Frankia conectada a la hifa (H) parental (la barra representa 1 µm).

Estudios de la diversidad genética de nuestras cepas de Frankia nativas, basados en la secuencia de la subunidad pequeña del

ADN

ribosomal y su comparación con otras cepas disponibles, reveló que los micro-simbiontes de plantas de esta familia, junto a aquellas de la familia Eleagnaceae, forman un grupo filogenético distintivo (Clawson y col., 1998), asignando a las cepas chilenas al "grupo Elaeagnus", y coincidiendo con sus capacidades infectivas (Carú y Cabello, 1999).

Por otra parte, en un estudio sobre la diversidad de Frankia en la localidad de El Romeral (Cajón del Maipo, Región Metropolitana, Chile), encontramos que un haplotipo dominante fue capaz de infectar todos las plantas estudiadas, y por lo tanto fue capaz de diseminarse en el área de estudio. La dominancia y la diseminación reflejan la habilidad de crecer y competir saprofíticamente en la rizosfera y por lo tanto de sobrevivir en el suelo. La diseminación de clones en el suelo es aún un proceso desconocido en bacterias, el cual podría producirse por un transporte pasivo por el agua, viento, invertebrados u otros agentes. En Frankia no existen estudios al respecto sino observaciones indirectas que muestran que es un microsimbionte capaz de colonizar la mayoría de las plantas que están relacionadas espacialmente. Además, encontramos una mayor diversidad genética que la reportada previamente entre los microsimbiontes de una zona de estudio reducida. Una explicación a este hallazgo podría ser que nuestro muestreo se hizo en nódulos de plantas que están creciendo en su hábitat nativo y por lo tanto ambos miembros de la simbiosis podrían tener mayor variabilidad genética, ya que otros estudios sugieren que una reducida diversidad genética se presenta cuando la planta es introducida (Chávez y Carú, 2006).

La simbiosis actinorrícica es un buen modelo para estudiar los cambios en la microbiota de la rizosfera, ya que se espera que la presencia de plantas actinorrícicas (e.g. Colletia hystrix) por su capacidad de establecer simbiosis con Frankia, incremente el ingreso de nitrógeno a la rizosfera, lo que se traduciría en diferencias en la estructura y función de la microbiota del suelo. El análisis de los fragmentos de la subunidad pequeña del

ADN

ribosomal, reveló diferencias en la estructura de las comunidades bacterianas asociadas a la rizosfera de las plantas actinorrícicas, no-actinorrícicas (plantas que no se asocian con Frankia) y en suelo sin cobertura vegetal. Los resultados obtenidos muestran que tanto la riqueza como la abundancia de los

TRF

s de la comunidad bacteriana del suelo sin cobertura vegetal, es menor que la asociada a las rizosferas. La comunidad bacteriana asociada a la rizosfera fue dominada principalmente por: Frankia, el grupo de bacterias rizobiales, Desulfovibrio sp. y Halomonas sp. Mientras que en el suelo sin cobertura vegetal las bacterias dominantes se identificaron como Pseudomonas sp. y Xanthomonas sp. En conjunto, estas observaciones indican que existen diferencias tanto en la composición como en la abundancia de las poblaciones bacterianas asociadas a la rizosfera y al suelo sin cobertura vegetal. En los estudios ecológicos se establece que la riqueza y la abundancia de las comunidades reflejan la presión que ejerce el tipo de rizosfera que moldea la diversidad en las comunidades. Así por ejemplo, se observó una mayor riqueza y abundancia de ribotipos en la rizosfera de C. hystrix, mientras que cuando analizamos estos parámetros en la rizosfera de las plantas no-actinorrícicas estos patrones cambian según la especie de planta. Esto nos indica que diferentes especies de plantas seleccionan distintas comunidades bacterianas (Farías y col., 2009a).

Por lo tanto, la diversidad genética de la comunidad microbiana en la rizosfera depende del tipo de cobertura vegetal asociada; no obstante, es más compleja en el suelo sin cobertura vegetal. Asimismo, se observó una mayor actividad de fijación de nitrógeno en muestras de suelo provenientes de la rizosfera de C. hystrix confirmando la relevancia ecológica de estas plantas, al comportarse como pioneras en la sucesión de comunidades vegetales en suelos pobres en nitrógeno, siendo algunas de gran valor en la recuperación y protección de suelos degradados y erosionados (Orlando y col., 2007).

Más información sobre Frankia y la simbiosis actinorrícica puede obtenerse de Carú y Schwencke, 2000; Schwencke y Carú, 2001.

1.3.2. Factores involucrados en la asociación de cianolíquenes antárticos y subantárticos

Los líquenes son asociaciones biológicas entre dos o tres organismos que establecen una simbiosis mutualista y, gracias a la interacción de sus componentes, son capaces de tolerar condiciones extremas, sobrevivir en ambientes pobres en nutrientes y ser pioneros en la colonización de diversos hábitats. Son asociaciones donde uno de los miembros es un hongo (micobionte) y el otro es un alga y/o una cianobacteria (cianobionte). En nuestro laboratorio hemos estudiado los factores que determinan el establecimiento exitoso de estas asociaciones. Entre ellos, los factores genéticos que definen su especificidad y los factores ambientales como la disponibilidad de los socios adecuados y las condiciones ecológicas del sitio (Recuadro 2). Se puso a prueba un modelo del proceso de liquenización que combina la disponibilidad, la especificidad y la selectividad de los socios, usando la asociación simbiótica de Peltigera-Nostoc como modelo biológico de estudio (Orlando y col., 2011) (Figura 5). Para ello se seleccionaron poblaciones de cuatro sitios de estudio: Reserva Nacional Coyhaique (Región de Aysén, Chile), Parque Natural Karukinka (Isla de Tierra del Fuego, Chile), Puerto Williams (Isla Navarino, Chile) y Bahía Balleneros (Isla Decepción, Antártica). En los sitios de muestreo del sur de Chile los líquenes se recolectaron desde matrices boscosas y praderas sin cobertura arbórea, mientras que las muestras antárticas provienen de una ladera de origen volcánico.

R

ECUADRO

2. R

EPRODUCCIÓN DE LOS LÍQUENES

.

Gran parte de los líquenes se reproduce de manera asexual, mediante la producción de propágulos vegetativos que incluyen ambos componentes simbióticos. Estos propágulos son capaces de germinar en una estructura conocida como pre-talo, la cual posteriormente se diferencia dando lugar al talo maduro, completando así el ciclo. Por otro lado, muchos de estos líquenes se reproducen sexualmente mediante la producción de esporas por parte del hongo, las cuales luego de germinar en el ambiente deben restablecer la simbiosis con un fotobionte disponible (de vida libre o proveniente de otro liquen), ya que los hongos formadores de líquenes no son capaces de sobrevivir por sí solos. De esta manera, si ocurre el encuentro con un fotobionte compatible, la asociación simbiótica se restablece dando origen en una primera etapa al pre-talo que luego se diferencia en el talo maduro. Sin embargo, si el encuentro ocurre con un fotobionte no compatible, entonces la asociación no será capaz de progresar más allá de la etapa de pre-talo y el liquen no se desarrollará. En este estado indiferenciado, el hongo es capaz de asociarse con otro fotobionte que se encuentre en las inmediaciones, el cual, si resulta ser compatible, dará origen a una liquenización exitosa.

La hipótesis planteada fue que si el encuentro (disponibilidad) de los socios adecuados (especificidad) es esencial en el establecimiento de las asociaciones simbióticas, y el éxito depende del contexto ambiental (selectividad); entonces, en un entorno más adverso, como las islas antárticas en comparación con los bosques nativos del sur de Chile, se espera una menor diversidad de cianobacterias en el sustrato asociado a los líquenes, así como una reducción de la selectividad del hongo.

Figura 5. Líquenes del género Peltigera. A. Ejemplar de la especie P. rufescens, la cual posee una distribución cosmopolita y se describe como una de las especies del género más común; B. Representante de la especie P. ponojensis, una especie recientemente descrita en Sudamérica; C. y D. Especímenes de la especie P. extenuata, de Tierra del Fuego y Antártica, respectivamente. Las barras representan 1 cm.

La identificación de los componentes de la simbiosis liquénica (micobionte Peltigera y cianobionte Nostoc) se realizó mediante análisis de marcadores moleculares específicos a partir de

ADN

. Se encontraron ocho grupos diferentes de micobiontes (hongos) y 15 de cianobiontes (cianobacterias) entre todas las muestras analizadas. A partir de estos datos se determinó la diversidad tanto de micobiontes como de cianobiontes en los diferentes ambientes de muestreo (Zúñiga y col., 2013a). En general, se observó una menor diversidad de ambos componentes en los líquenes de ambientes más adversos (praderas y ladera volcánica) en comparación a los de matrices boscosas, las cuales presentarían mejores condiciones para el desarrollo de estos individuos (Ramírez-Fernández y col., 2013).

Por otra parte, a partir de muestras de los sustratos donde se desarrolla cada liquen y utilizando marcadores moleculares del

ADN

de las cianobacterias, se determinó cuántos tipos de cianobacterias de vida libre relacionadas con los cianobiontes existentes en los líquenes estaban disponibles en cada hábitat. En los sustratos se detectó solo el 60% de los cianobiontes presentes en los líquenes (Zúñiga y col., 2013b).

Integrando todos los datos, se calculó la selectividad de los diferentes micobiontes. Esta selectividad se define como la asociación preferencial del hongo (micobionte) con alguno de sus cianobiontes específicos, considerando la proporción en que estos últimos se encuentran disponibles en el ambiente. Para ello se adaptó un índice de selectividad (o índice de elegibilidad) que nos permitió evaluar la selectividad promedio de los micobiontes en los diferentes sitios de muestreo. Los datos revelaron que la selectividad promedio de los micobiontes disminuyó a medida que aumentó la latitud de los sitios de estudio (Zúñiga y col., 2013a, Leiva y col., 2013), confirmando nuestra hipótesis inicial en la que se esperaba encontrar una menor selectividad en los micobiontes antárticos. Sin embargo los resultados deben ser interpretados cuidadosamente debido a la extremadamente baja diversidad de cianobiontes en los sustratos del ambiente más extremo.

Por otra parte, aunque la diversidad de los componentes simbióticos de los líquenes ha sido extensamente estudiada, es muy reciente y escaso el estudio de la diversidad de la comunidad bacteriana asociada al liquen, a pesar de que se conoce su presencia desde hace largo tiempo. A partir del

ADN

extraído de muestras del Parque Natural Karukinka, tanto desde el talo del liquen como del sustrato asociado a cada uno de ellos, se analizaron las regiones variables de la subunidad pequeña del

ADN

ribosomal bacteriana mediante

TRFLP

. Los perfiles moleculares indicaron que en las muestras obtenidas directamente del talo del liquen no solo existía un

TRF

perteneciente al cianobionte que forma parte de la asociación simbiótica, sino que además existen otros

TRF

s. Estos datos confirman que existe una comunidad bacteriana asociada íntimamente al talo del liquen, la cual constituye el microbioma del liquen y es distinta a la comunidad presente en el sustrato asociado. Estos resultados concuerdan con trabajos previos donde se han encontrado ensambles microbianos altamente estructurados, formando una biopelícula sobre el talo del liquen. Además, los perfiles obtenidos a partir del sustrato asociado parecen ser más homogéneos; por el contrario, los perfiles asociados al talo liquénico muestran una mayor diversidad de

TRF

s y presentan una notoria mayor cantidad de

TRF

s exclusivos, separándose de acuerdo a los contextos ambientales de los cuales ellos derivan (Ramírez-Fernández y col., 2014).

En uno de los sitios de estudio se desarrolló una guía de campo de los macrolíquenes existentes (Parque Natural Karukinka). Esta información puede servir como base para reforzar la importancia de la biodiversidad liquénica y proporciona material para incorporar nuevas ofertas productivas en relación con la observación de especies, constituyendo una alternativa complementaria al uso no consuntivo de la flora y la fauna (Farías y col., 2012).

1.3.3. Los socios microscópicos de una planta invasora

Otra línea de trabajo en el laboratorio ha sido el estudio de comunidades microbianas asociadas a especies introducidas. La invasión de nuevos hábitats por especies no nativas representa uno de los componentes más importantes del cambio climático global. Chile no se encuentra exento de la presencia de especies invasoras ya que cuenta aproximadamente con 690 especies de plantas introducidas. Una de estas especies exóticas es Eschscholzia californica, comúnmente conocida como dedal de oro (Figura 6), una planta nativa de la costa oeste de Norteamérica que fue introducida en la región de Chile Central a finales del siglo

XIX

con propósitos ornamentales y 100 años después se encuentra ampliamente distribuida desde la cuarta hasta la novena región, incluyendo la región Metropolitana. La amplia y rápida distribución de E. californica por la zona central chilena constituye un claro ejemplo del éxito que pueden tener las especies introducidas en nuevos hábitats. Durante varios años las investigaciones relacionadas con las plantas invasoras se han dirigido fundamentalmente al estudio de las interacciones entre estas y las comunidades de plantas nativas, observándose en las áreas invadidas el desplazamiento de las especies nativas y cambios en los ciclos biogeoquímicos. Sin embargo, el papel que desempeñan las comunidades microbianas del suelo durante la invasión y el efecto de las plantas invasoras sobre la microbiota del suelo son temas recientes. Algunos trabajos describen cambios en la estructura de la microbiota del suelo durante el proceso de invasión de Centaurea maculosa, C. diffusa y Acacia dealbata, pero aún son escasas las investigaciones que abordan el papel que desempeña la interacción planta-microorganismos en el contexto de las invasiones biológicas en diferentes ecosistemas. En consideración a lo anterior, se evaluó el impacto de E. californica sobre la estructura de la microbiota del suelo de un área invadida (Farellones, Chile Central). Para determinar la diversidad genética de la microbiota asociada a la planta invasora se analizaron los perfiles de

TRFLP

del

ADN

que codifica para la subunidad pequeña del ribosoma de bacterias, arqueas y hongos. Asimismo, la diversidad metabólica de la comunidad microbiana se determinó mediante perfiles fisiológicos (Biolog EcoPlate™). Los resultados obtenidos indican que la invasión por E. californica aumenta el pH y el contenido hídrico del suelo provocando cambios en la diversidad metabólica sin alterar mayormente la diversidad genética de la comunidad microbiana del suelo (Pizarro y col., 2011). Teniendo en cuenta estos resultados se decidió abordar el impacto de la planta a nivel de la composición bacteriana del suelo. Para ello se construyeron genotecas de la subunidad pequeña del

ADN

ribosomal a partir de muestras de suelos invadidos y no invadidos por la planta. Se obtuvo un total de 912 perfiles, los cuales se agruparon en 450

OTU

s (unidades taxonómicas operacionales); de estas, el 30% y 38% se encontraron exclusivamente en suelos invadidos y no invadidos, respectivamente. El 32% restante se detectó en ambas condiciones del suelo. El análisis posterior de los clones secuenciados arrojó que la planta, a nivel de phylum, no afecta la riqueza de la comunidad bacteriana, aunque se observaron cambios menores en la abundancia de algunos grupos como las β-Proteobacterias que fueron menos abundantes en suelos invadidos (De Armas y col., 2013a).

Posteriormente, con el fin de evaluar si la instalación de E. californica en un suelo no invadido por la planta produce cambios sucesivos en la estructura de la comunidad microbiana del suelo, se diseñó un experimento de jardín común (Recuadro 3) en el cual se determinó la diversidad genética y funcional de tres grupos microbianos (bacterias, arqueas y hongos) en tres estados del desarrollo de la planta: durante la floración, en la etapa de producción de frutos y en la senescencia de la planta. A nivel genético no se observaron diferencias marcadas en la diversidad de la microbiota de los suelos control e invadidos. Sin embargo, a nivel funcional, se observaron diferencias en las cinéticas metabólicas en la segunda y tercera toma de muestras (De Armas y col., 2013b). Por otra parte, los índices de diversidad metabólica de los suelos invadidos fueron significativamente más altos que los de los suelos no invadidos (De Armas y col., 2013c). Estos resultados indican una relación directa entre las etapas fenológicas de la planta y la estructura funcional de la microbiota del suelo.

Figura 6. Eschscholzia californica, una planta invasora en Chile. A. Ejemplar de E. californica, comúnmente conocida como dedal de oro; B. Experimento de jardín común con representantes de dos poblaciones de E. californica ubicadas a diferentes altitudes en la localidad de Farellones (Chile Central).

R

ECUADRO

3. E

XPERIMENTOS DE JARDÍN COMÚN

.

Los experimentos de trasplantes más utilizados en estudios ecológicos son los de jardín común y trasplante recíproco. Los experimentos de jardín común son aquellos en que dos o más organismos se mueven desde su ambiente a un entorno en común. En un experimento habitual de jardín común, dos especies de plantas que crecen en sus ambientes nativos son trasplantadas a un mismo ambiente. Por otro lado, el trasplante recíproco implica la introducción de organismos a partir de cada uno de